一种胚胎培养用轻质矿物油的制备方法.pdf
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 CN 114015469 A(43)申请公布日 2022.02.08(21)申请号 202111487204.9(22)申请日 2021.12.08(71)申请人 江苏易核科学仪器有限公司地址 210000 江苏省南京市鼓楼区江东北路388号1单元2402(72)发明人 严正杰 岳挺 侯道荣 吴媛媛 刘银燕 陈雪梅 孙淼 (51)Int.Cl.C10G 21/02 (2006.01)权利要求书1页 说明书3页 附图3页(54)发明名称一种胚胎培养用轻质矿物油的制备方法(57)摘要本发明公开了一种胚胎培养用轻质矿物油 的制备方法，以轻质矿物油（密度0.84‑0.86）为 原料，主要纯化剂为乙二胺四乙酸，溶剂为灭菌 注射用水，经乙醇溶液、氯化钠溶液、乙二胺四乙 酸溶液纯化后得到胚胎培养用轻质矿物油，本制 备方法简便快速，可有效降低矿物油内重金属、 内毒素、核酸的含量，用本方法获得的轻质矿物 油进行胚胎培养，可获得较高的囊胚形成率，适 用于大专院校、科研院所、生殖中心的胚胎培养 操作。 A9 6 4 5 1 0 4 1 1N C CN 114015469 A权 利 要 求 书1/1页1.一种胚胎培养用轻质矿物油的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：液的配制（1）乙醇溶将无水乙醇和灭菌注射用水按体积比=1：（1‑4），充分混合；（2）氯化钠溶液的配置取0.6‑1.8g氯化钠充分溶解于100ml灭菌注射用水中；（3）乙二胺四乙酸溶液的配制取0.001‑0.01g乙二胺四乙酸充分溶解于100ml灭菌注射用水中；（4）胚胎培养用轻质矿物油的制备（A）将轻质矿物油和步骤（1）制得的乙醇溶液按体积比=1：（1‑5）震荡混匀后，静置分 层，取上层轻质矿物油；（B）将步骤（A）获得的轻质矿物油和步骤（2）制得的氯化钠溶液按体积比=1：（1‑3）震荡 混匀后，静置分层，取上层轻质矿物油；（C）将步骤（B）获得的轻质矿物油和步骤（3）制得的乙二胺四乙酸溶液按体积比=1：（1‑ 8）震荡混匀后，静置分层，取上层轻质矿物油；（D）将步骤（C）获得的轻质矿物油进行干热灭菌，冷却后分装，获得胚胎培养用轻质矿 物油。2.根据权利要求1所述的一种胚胎培养用轻质矿物油的制备方法，其特征在于，所述轻 质矿物油为密度0.84‑0.86的轻质石蜡油。3.根据权利要求1所述的一种胚胎培养用轻质矿物油的制备方法，其特征在于，步骤 （4）中所述的震荡混匀是通过500‑1000r/min摇床震荡10‑60min实现。4.根据权利要求1所述的一种胚胎培养用轻质矿物油的制备方法，其特征在于，步骤 （4）中的步骤（C）所述的干热灭菌是通过150‑160℃加热60‑120min实现。5.根据权利要求1‑4的制备方法获得胚胎培养用轻质矿物油。22 CN 114015469 A说 明 书1/3页一种胚胎培养用轻质矿物油的制备方法 技术领域 本发明涉及胚胎培养技术领域，具体涉及一种胚胎培养用轻质矿物油的制备方 法。 背景技术 轻质矿物油覆盖液滴培养系统已广泛用于哺乳动物早期胚胎的体外培养，其主要 目的是防止培养液蒸发，维持培养液的pH值、渗透压及湿度的稳定。 轻质矿物油属于石油提炼加工产物，存在重金属离子、过氧化物等毒性，不同实验 室采用很多方法进行验证，证明不同品牌、不同来源的轻质矿物油未提纯时均具有胚胎毒 性，必须经过提纯加工后才可用于胚胎培养。 目前胚胎培养用轻质矿物油的制备方法有多种，例如标准培养液平衡处理法、三 蒸水洗法、水洗与离心法等等，上述这些方法装置复杂又费时，且未涉及重金属离子的萃 取，造成因轻质矿物油本身品质不同导致的胚胎培养用轻质矿物油质量参差不齐。因此，需 要找到一种快速、简便并且高效的胚胎培养用轻质矿物油的制备方法。 发明内容 针对现有技术不足之处，本发明在于提供一种胚胎培养用轻质矿物油的制备方 法，本方法获得的轻质矿物油使用安全，品质优良，进行胚胎培养可获得较高的囊胚形成 率。 为了达到上述目的，本发明提供了一种胚胎培养用轻质矿物油的制备方法，主要 成分包括：轻质矿物油、灭菌注射用水、无水乙醇、氯化钠、乙二胺四乙酸。 生产胚胎培养用轻质矿物油的技术方案如下。 1．乙醇溶液的配制用量筒分别将无水乙醇和灭菌注射用水按体积比 1：（1‑4）量取，在玻璃试剂瓶内 充分混合。 2．氯化钠溶液的配制准确称取0.6‑1.8g氯化钠置于玻璃试剂瓶内，用量筒量取100ml灭菌注射用水倒 入玻璃试剂瓶内，充分溶解。 3．乙二胺四乙酸溶液的配置准确称取0.001‑0.01g乙二胺四乙酸置于玻璃试剂瓶内，用量筒量取100ml灭菌注 射用水倒入玻璃试剂瓶内，充分溶解。 4．胚胎培养用轻质矿物油的制备。 具体操作过程包括以下步骤。 （A）将轻质矿物油和乙醇溶液按体积比1：（1‑5）震荡混匀后，静置等待油水分层， 取上层轻质矿物油。 （B）将步骤（A）获得的轻质矿物油和氯化钠溶液按体积比=1：（1‑3）震荡混匀后，静33 CN 114015469 A说 明 书2/3页 置等待油水分层，取上层轻质矿物油。 （C）将步骤（B）获得的轻质矿物油和乙二胺四乙酸溶液按体积比=1：（1‑8）震荡混 匀后，静置等待油水分层，取上层轻质矿物油。 （D）将步骤（C）获得的轻质矿物油进行干热灭菌，冷却后分装，获得胚胎培养用轻 质矿物油，冷藏保存。 优选的，为了保证干热灭菌效果，步骤D中的干热灭菌是通过150‑160℃加热60‑ 120min实现。 本发明的有益效果如下。 1．本发明提供了一种简便高效的胚胎培养用轻质矿物油的制备方法，经过本纯化 方法获得的轻质矿物油囊胚形成率高，重金属含量、内毒素含量、过氧化物含量明显降低。 2．本发明采用密度0.84‑0.86的轻质石蜡油；溶剂采用灭菌注射用水，符合中国药 典标准，内毒素、TVOC、金属离子浓度极低，避免再提纯过程中污染轻质矿物油；本制备方法 中所使用的乙醇溶液、氯化钠溶液、乙二胺四乙酸溶液均为水溶性，不溶于轻质矿物油，安 全性高；乙醇溶液可沉淀轻质矿物油中蛋白质，氯化钠溶液可去除轻质矿物油中核酸残留、 乙二胺四乙酸溶液可螯合轻质矿物油中重金属残留。 3．本发明获得胚胎培养用轻质矿物油可用于高校、科研院所及生殖中心的体外受 精及胚胎培养，纯化工艺快捷简便，不需要特殊的仪器设备，能够降低使用成本。 具体实施方式 以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明，对本技术领域的技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，做出的改进和修饰也属于本发明的保护范围。 实施例 1.轻质矿物油的制备。 （1）乙醇溶液的配制用量筒分别将无水乙醇和灭菌注射用水按体积比=1：4量取，在玻璃试剂瓶内充分 混合。 （2）氯化钠溶液的配制准确称取0.9g氯化钠置于玻璃试剂瓶内，用量筒量取100ml灭菌注射用水倒入玻 璃试剂瓶内，充分溶解。 （3）乙二胺四乙酸溶液的配置准确称取0.01g乙二胺四乙酸置于玻璃试剂瓶内，用量筒量取100ml灭菌注射用水 倒入玻璃试剂瓶内，充分溶解。 （4）胚胎培养用轻质矿物油的制备具体操作过程包括以下步骤。 （A）将轻质矿物油和乙醇溶液按体积比=1： 5混合，在1000r/min摇床震荡60min混 匀后，静置等待油水分层，取上层轻质矿物油。 （B）将步骤（A）获得的轻质矿物油和氯化钠溶液按体积比=1：3混合，在1000r/min 摇床震荡60min混匀后，静置等待油水分层，取上层轻质矿物油。44 CN 114015469 A说 明 书3/3页 （C）将步骤（B）获得的轻质矿物油和乙二胺四乙酸溶液按体积比=1： 8混合，在 1000r/min摇床震荡60min混匀后，静置等待油水分层，取上层轻质矿物油。 （D）将步骤（C）获得的轻质矿物油进行160℃加热120min干热灭菌，冷却后分装，获 得胚胎培养用轻质矿物油，冷藏保存。 2.轻质矿物油的小鼠胚胎培养检测。 本试验以C57BL/6雌性小鼠为研究对象，鼠龄7‑8周，SPF级。普通级动物房饲养，室 温范围20‑25℃，湿度范围40%‑70%，自由饮水和采食。光照周期为12小时光照12小时黑暗交 替进行。小鼠在试验前进行一周适应性饲养。 试验分为阳性对照组、阴性对照组和供试品组。 （1）阳性对照组，采用进口胚胎培养用矿物油覆盖胚胎培养液。 （2）阴性对照组，采用未经提纯的轻质矿物油覆盖胚胎培养液。 （3）供试品组，采用本发明获得的轻质矿物油覆盖胚胎培养液。 雌鼠约17:00‑17:30腹腔注射5IU/只的PMSG促卵泡发育，间隔48小时后注射5IU/ 只的HCG诱导排卵。注射HCG当日和雄鼠合笼过夜。 第二天将见栓小鼠处死放在吸水纸上，用75%的乙醇消毒腹部。用手指捏住皮肤并 用眼科弯剪在皮肤上做一小切口。然后用力将皮肤拉到头部，完全暴露腹部。然后剪开腹 膜，完全暴露内脏器官。将肠管拉向一侧后即可在腹腔中见到两侧的子宫和相连的卵巢。卷 曲的输卵管在卵巢和子宫之间。用眼科镊夹住子宫将其提起，这有利于将子宫和腹膜分离 开。用眼科剪在膜上刺破一小口，然后将子宫分离下来。仍用镊子夹住子宫，用显微剪在卵 巢和输卵管之间剪开。切口必须尽可能的接近输卵管。将镊子移到输卵管处夹住输卵管，在 输卵管和子宫之间在剪一刀。将输卵管放入含有HTF的平皿中。将另一侧的输卵管按同样的 方法取下来。在显微镜下观察输卵管（10～20倍放大），可见其为具有一透明的膨大部的不 透明的一团。用一个1ml注射器针头按住输卵管，另一个针头将膨大部撕开。卵团立刻溢出 输卵管，用移卵管将收集所有的卵丘复合物转移到透明质酸酶皿中，去除颗粒细胞获得裸 卵，将裸卵分别移入阳性对照组、阴性对照组和供试品组，每组均为50个卵，最后将3组放在 37℃、5%CO2的培养箱中培养。 鼠胚实验合格标准：培养96小时后观察并记录囊胚数量；囊胚形成率＞85%为合 格；经统计学分析，供试品组的囊胚形成率显著高于阴性对照组，供试品组的囊胚形成率与 阳性对照组相比无显著性差异。 附图说明试品组）。（图1为阳性对照组、图2为阴性对照组、图3为供55 CN 114015469 A说 明 书 附 图1/3页图166 CN 114015469 A说 明 书 附 图2/3页图277 CN 114015469 A说 明 书 附 图3/3页图388
